在4月28日開播的“常見細胞污染類型及解決方法"課程中，有很多老師就細胞污染提出了疑問。我們篩選出部分代表性問題，并作了詳細解答。

01

Q：在細胞培養(yǎng)液中，有種可以游動的蟲子是什么污染？

A：是細菌污染。帶鞭毛的細菌就是會游動的。

02

Q：有很多黑點，在原位顫抖，沒那么明顯的定向運動，是什么污染？

A：細胞碎片、血清沉淀和有些細菌污染，都會在原位顫抖。前者是原地做不規(guī)律的布朗運動，細菌是原地轉動，頻率會高很多。

03

Q：血清的絮狀物雜質屬于正常現象嗎？

A：血清里面有一些大分子蛋白和一些纖維析出，呈現絮狀，也有一些磷酸鈣析出呈現小黑點，這些都是很常見的。沉淀太多，可以離心去掉部分。血清沉淀的多少也跟血清的溶解方式有關，溶解過程中最好是4℃，期間不時搖晃進行溶解。根據普諾賽多年培養(yǎng)細胞經驗，血清的沉淀多與少并不決定血清質量。

04

Q：液體變微黃、渾濁怎么解決？

A：這個是典型的細菌污染。如果細胞形態(tài)尚且完整，可以嘗試用10%的雙抗清洗去除，或者使用別的抗生素清除，如慶大霉素50U/mL、四環(huán)素10μg/mL等；如果細胞狀態(tài)已經很差，就沒有挽救的價值了。

05

Q：為什么有的培養(yǎng)基天天需要換液呢？

A：正常情況下，是不需要每天換液的。培養(yǎng)基橘黃色是細胞比較喜歡的環(huán)境，正常是2~3天換一次比較好，換液多了細胞狀態(tài)反而容易受影響。如果是因為培養(yǎng)基異常消耗，才需要每天換液，那么我們要做的是找到異常消耗的原因，是細胞量過多，還是有其他細菌或者支原體污染。先找到原因才能不用每天換液。

06

Q：我凍存的細胞，每次復蘇養(yǎng)幾天就污染了，是什么原因呢？

A：如果凍存前就帶進去了污染，那么同一批次的復蘇出來都會有污染。這種情況下，可以在復蘇當天給予抗生素清除（不能用雙抗），如慶大霉素50U/mL、四環(huán)素10μg/mL等；如果同一批有復蘇沒有污染的情況，要考慮復蘇過程，建議換一下水浴鍋的水和其他試劑耗材再復蘇。

07

Q：細胞培養(yǎng)不生長，傳代擴不起來，是不是就是支原體污染？

A：支原體污染肉眼是很難區(qū)分的，支原體污染會導致細胞狀態(tài)變差，但是細胞狀態(tài)變差并不是都是支原體造成的，所以我們還是要用支原體檢測加以區(qū)分。

08

Q：培養(yǎng)基污染以后，可以過濾一下繼續(xù)使用嗎？

A：不建議繼續(xù)使用。培養(yǎng)基里面可能會有殘留的細菌分泌物，比如內毒素等，可能會影響細胞生長。

09

Q：培養(yǎng)箱水盤用什么抑菌劑？

A：傳統(tǒng)方法用硫酸銅，但是硫酸銅屬于重金屬，還是有一定的毒性的。建議使用水浴鍋安全衛(wèi)士，安全無毒，可以持續(xù)一周無菌狀態(tài)。

10

Q：試劑已經全部換新的了，還是一直污染，是什么原因？

A：如果試劑盒耗材全部更換了，還需要排除下凍存前是否有污染。再就是是否存在操作問題，可考慮換其他人養(yǎng)一下試試。

11

Q：懸浮細胞碎片形成的黃團怎么處理呢？

A：懸浮細胞碎片形成的黃團可以通過低速離心去除，前提是細胞量一定要夠多，轉速一般可以降低到800rpm左右。離心完上清別急著丟，先看下細胞是否已經離心下來，也可以根據細胞大小調節(jié)離心轉速。

12

Q：細胞里面有一些小方塊一樣的東西，是什么原因？

A：小方塊一般是結晶類的。可以先用培養(yǎng)基或者PBS稀釋溶解后換液，看有沒有改善。

13

Q：放了五個月的*培養(yǎng)基，出現絮狀懸浮物，但是觀察不是細菌，可以過濾后加點血清繼續(xù)使用嗎？

A：不建議繼續(xù)使用。絮狀物首先要排除霉菌類的污染；即使排除了霉菌，完培產生絮狀物析出了，也會對成分有一定的影響，影響后期培養(yǎng)細胞。

14

Q：飼養(yǎng)雜交瘤細胞，如果觀察有沒有污染，大概要在多大倍鏡下觀看？

A：觀察污染的話400倍鏡就夠了，10X目鏡加40X物鏡。

15

Q：請問貼壁細胞表面有白膜，培養(yǎng)液惡臭，是什么原因導致的污染？

A：有白膜和惡臭應該是有污染無疑了，還很嚴重，具體是細菌還是真菌，要結合顯微鏡下的菌體形態(tài)來進一步區(qū)分。

16

Q：細胞污染后，用10倍雙抗處理后，沒有再長，這時細胞可以凍存嗎？

A：細菌不再生長，恢復正常1%抗生素后一周內沒有再長起來，就是清除干凈了，可以凍存。

17

Q：孵箱中一瓶細胞有黑膠蟲污染，慢慢地整個孵箱都有污染了，那孵箱怎么打掃？

A：把細胞全部轉移走，再用消毒液把培養(yǎng)箱全部擦拭一遍；培養(yǎng)箱水一定要清理干凈；培養(yǎng)箱角落和表面都噴上細胞房衛(wèi)士，關閉培養(yǎng)箱保持30分鐘，再打開散氣30分鐘，換上干凈的無菌水就行了。

18

Q：請問培養(yǎng)箱滅菌水多久換一次呢？換的時候每次都要90℃滅菌么？

A：水浴鍋的滅菌水不加抑菌劑的話，建議是每次復蘇前都更換新的；加了水浴鍋安全衛(wèi)士，可以一周換一次，水是121℃滅菌20分鐘。

19

Q：液氮有沒有可能污染？

A：理論上液氮這種極-端的環(huán)境里，是不會有生物存活的，細菌凍存也是需要保護劑的。

20

Q：新復蘇的細胞，一天后正常貼壁，但是培養(yǎng)液里懸浮大量的黑色團塊，是什么原因呢？

A：可能是有細菌污染了，還是要結合顯微鏡下的黑團形態(tài)來進一步確診。

5月直播課“細胞傳代增殖問題"，將于5月26日開播，大家記得關注哦~