血清成份復(fù)雜，里面包含抑制分化的因子，也包含促進(jìn)分化的因子；間充質(zhì)干細(xì)胞一類(lèi)成體干細(xì)胞大多可以用血清培養(yǎng)，單能干細(xì)胞，用血清不會(huì)分化；胚胎干會(huì)細(xì)胞分化。

血清的刺激分化主要與血清品質(zhì)相關(guān)，品質(zhì)高的可以維持干細(xì)胞增殖，抑制分化；品質(zhì)較低的如新生牛血清會(huì)誘導(dǎo)分化；與生產(chǎn)批次也有關(guān)系，不同批次因子含量不一，分化效果不一。

? 篩選品質(zhì)高的血清批次；

? 添加抑制分化的因子，如bFGF，EGF等；

? 及時(shí)傳代，控制密度，刺激增殖，高密度會(huì)引起分化；

? 及時(shí)換液，防止代謝累積，刺激分化；

? 控制培養(yǎng)基質(zhì)量如內(nèi)毒素、支原體、pH等等，控制環(huán)境穩(wěn)定。

細(xì)胞密度高的時(shí)候，消化3~4 min 才能完-全消化下來(lái)，細(xì)胞高密度下生長(zhǎng)速度快，低密度下細(xì)胞增殖慢甚至死亡，建議傳代比例控制在1:2~1:4，不要超過(guò)1:4。

細(xì)胞分化了之后是不會(huì)再增殖的。細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)前期，細(xì)胞還能緩慢增殖，但隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展，漂浮的細(xì)胞越來(lái)越多，這時(shí)候要分不同的情況處理：

? 如果實(shí)驗(yàn)前，細(xì)胞長(zhǎng)得過(guò)滿(mǎn)，可能因?yàn)榻佑|抑制產(chǎn)生較多漂浮細(xì)胞。這種情況下，只要貼壁的細(xì)胞沒(méi)有受到影響，實(shí)驗(yàn)可以繼續(xù)；

? 另一種情況，是實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)的密度合適，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，貼壁的細(xì)胞慢慢脫落漂浮，這種情況是不正常的，需要結(jié)合實(shí)驗(yàn)前細(xì)胞狀態(tài)、實(shí)驗(yàn)所用的誘導(dǎo)試劑對(duì)細(xì)胞的影響等多方面的因素去調(diào)整。

正常培養(yǎng)的細(xì)胞系是沒(méi)有梯度離心這個(gè)概念的，梯度離心通常是用于細(xì)胞提取時(shí)，多種細(xì)胞混合在一起的一種分離措施。懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程中會(huì)始終伴隨著細(xì)胞的死亡，細(xì)胞死亡后裂解就會(huì)產(chǎn)生碎片。這種可以通過(guò)低速離心（800 rpm，3~5 min）去除一部分，但無(wú)法完-全去除。

懸浮細(xì)胞需要計(jì)數(shù)來(lái)判斷。貼壁細(xì)胞可以看不同視野下細(xì)胞的密度，以大多數(shù)視野下的密度為準(zhǔn)。需要注意的是，不是所有細(xì)胞都會(huì)平鋪單層，有些細(xì)胞可能會(huì)堆疊生長(zhǎng)，比如Hep G2。

THP-1是一類(lèi)單核細(xì)胞，可以在特定的情況下分化為M0型的巨噬細(xì)胞，這時(shí)的細(xì)胞就是會(huì)貼壁的。培養(yǎng)的過(guò)程中如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)了貼壁的情況，傳代的時(shí)候可以只收集漂浮的細(xì)胞。同時(shí)排查實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境、培養(yǎng)基、血清等，看看有沒(méi)有什么特定的影響因素導(dǎo)致細(xì)胞貼壁。

細(xì)胞培養(yǎng)傳代次數(shù)多了，會(huì)存在狀態(tài)越來(lái)越差的情況?？梢栽诩?xì)胞狀態(tài)好的時(shí)候，一邊傳代，一邊凍存。NK-92細(xì)胞有很強(qiáng)的IL-2依賴(lài)性，培養(yǎng)時(shí)要注意避免過(guò)度吹打，團(tuán)塊吹散的同時(shí)，細(xì)胞也容易受損。培養(yǎng)過(guò)程中，一方面需要注意及時(shí)添加IL-2，一方面也需要注意吹打次數(shù)，一般輕輕吹2~3下將大團(tuán)吹成小團(tuán)就可以了。

需要結(jié)合具體的細(xì)胞及圖片具體分析。如果是一些有成脂能力的細(xì)胞，不排除是細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程中受到某種刺激分化形成了脂滴。除此以外，還需要排除器皿本身的影響。最后結(jié)合顯微鏡下的圖片及視頻進(jìn)行判斷，看是否有明顯微生物的痕跡。如果上述方法都無(wú)法判斷，必要時(shí)，可以收集細(xì)胞培養(yǎng)液置于37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行空培養(yǎng)，觀(guān)察是否有明顯的微生物增殖。

細(xì)胞復(fù)蘇后老化，可能是因?yàn)榧?xì)胞凍存前的狀態(tài)不佳，以及凍存時(shí)的保存活性效果不好，這些都會(huì)影響細(xì)胞狀態(tài)，其中凍存損傷影響比較常見(jiàn)。建議控制凍存前狀態(tài)、控制凍存過(guò)程及凍存液確保細(xì)胞活率。

一般誘導(dǎo)效果好，脂滴大，相差顯微鏡白光可以觀(guān)察到油滴，可能會(huì)存在誤判，建議使用標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，用油紅O染色方法鑒定。

懸浮細(xì)胞通常是當(dāng)天按實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞量接種細(xì)胞，后續(xù)配置轉(zhuǎn)染復(fù)合物，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物滴加到培養(yǎng)基中，根據(jù)摸索好的轉(zhuǎn)染時(shí)間，收樣檢測(cè)。

設(shè)置好分組，空白對(duì)照、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、DNA、siRNA、DNA和siRNA共轉(zhuǎn)染（用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋DNA和siRN及DNA，無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋轉(zhuǎn)染試劑），摸索適宜的濃度、比例、轉(zhuǎn)染時(shí)間。

大多數(shù)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)都會(huì)聚團(tuán)，還有些懸浮細(xì)胞本身就是聚團(tuán)長(zhǎng)的，不聚團(tuán)說(shuō)明細(xì)胞活性較差，如NK-92細(xì)胞。培養(yǎng)本身是聚團(tuán)生長(zhǎng)的懸浮細(xì)胞，是不可以減少細(xì)胞團(tuán)的。如果是存在少數(shù)聚團(tuán)，大部分單顆懸浮的細(xì)胞，可以將細(xì)胞進(jìn)行高密度培養(yǎng).一般密度在200萬(wàn)/mL時(shí)，細(xì)胞大部分是單顆分散的。

這是一株對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高的懸浮細(xì)胞，培養(yǎng)的時(shí)候需要添加β-巰基乙醇。如果細(xì)胞剛復(fù)蘇就生長(zhǎng)緩慢，可以先用臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞的活性。如果是復(fù)蘇時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)較好，但傳代后生長(zhǎng)緩慢，可能是培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)不夠，比如沒(méi)有加β-巰基乙醇等。另外，細(xì)胞不增殖可能與接種時(shí)的密度太低有關(guān)。懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是有密度要求的，一般情況下密度控制在50-200萬(wàn)/mL為佳，密度太低了，細(xì)胞增殖緩慢，密度太高了，細(xì)胞可能會(huì)慢慢裂解死亡。